PCR擴(kuò)增試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)謩e配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品則取0.3ml（不要少于0.3ml）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
PCR擴(kuò)增試劑盒使用時(shí)要注意基礎(chǔ)程序、擴(kuò)增溫度和延伸溫度、反應(yīng)時(shí)間、循環(huán)次數(shù)、PCR反應(yīng)液的配制、PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以及PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。
若在進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)雜帶該如何處理？
對(duì)于該現(xiàn)象可能的原因和對(duì)應(yīng)的處理策略如下：
1.引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。
2.循環(huán)的次數(shù)過(guò)多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。
3.酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。
4.退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2℃為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。
5.樣品處理不當(dāng)。
6.Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。
7.若為PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題。推薦使用PCR擴(kuò)增試劑盒，添加改良的DNA聚合酶，大大提高擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和保真性。
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更新時(shí)間：2022-08-23
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